Identificare e convalidare nuovi bersagli farmacologici in modelli preclinici che ricordano da vicino la malattia umana. E’ questo l’obiettivo principale dell’azienda AstraZeneca che ha annunciato quattro collaborazioni di ricerca volte a sfruttare la potenza delle tecnologie di editing del genoma umano, su tutta la sua piattaforma di ricerca in aree terapeutiche chiave dell'azienda.

AstraZeneca condividerà linee cellulari e composti con i suoi partner e lavorerà nell’intento di pubblicare i risultati, derivanti dall’applicazione della tecnologia CRISPR/Cas, in riviste peer-reviewed, contribuendo al più ampio progresso scientifico nel campo.

CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR associated protein) è uno strumento di editing del genoma, che permette agli scienziati di effettuare cambiamenti mirati all’interno di geni di interesse terapeutico o biotecnologico molto più velocemente e in modo molto più preciso che mai.

Ma come funziona questa tecnologia CRISPR/Cas? Ne abbiamo parlato con un esperto, il dr. Angelo Lombardo, Ricercatore presso l’Università Vita-Salute San Raffaele e Project Leader dell’Istituto Telethon per la Terapia Genica del san Raffaele, IRCCS Ospedale San Raffaele.

«La tecnologia  delle CRISPR/Cas è stata sviluppata negli ultimi due-tre anni. Si basa su un processo naturale che avviene nei batteri che è stato inizialmente scoperto circa 10 anni fa; questo processo consiste nel distruggere le sequenze geniche esogene che invadono i batteri.  Infatti, anche i batteri hanno dei virus che possono infettarli. Questi virus possono essere inattivati dal sistema CRISPR/Cas che si basa sull’utilizzo di corti RNA (esattamente le sequenze CRISPR) per guidare la proteina Cas9 nel sito complementare a questi corti RNA, dove la proteina induce una rottura del DNA ».

Questa è stata definita dal dr. Lombardo un’importantissima scoperta, in quanto è una delle poche dimostrazioni che anche i batteri hanno una modalità per difendersi da agenti esterni che li attaccano, un po’ come il nostro sistema immunitario. Nel caso dei batteri, i virus che li infettano sono denominati batteriofagi.

«Durante un’infezione da parte del batteriofago -ha proseguito il dr. Lombardo-  i batteri inseriscono nel loro DNA le sequenze che derivano dal batteriofago. Quindi il batterio ogni volta che è infettato da un batteriofago diverso immagazzina e quindi memorizza nel proprio codice genetico alcune sequenze del batteriofago. Queste informazioni acquisite vengono in seguito utilizzate durante un infezione successiva per guidare la proteina Cas9 contro il DNA dello stesso batteriofago.

Infatti, il DNA che il batterio riceve dal virus viene utilizzato per formare delle piccole sequenze di RNA (i CRISPR) che saranno poi complementari al DNA del batteriofago che infetterà la cellula in un momento successivo. E’ un po’ come i nostri linfociti che ricordano un incontro precedente con un antigene e rispondono anche in maniera più vigorosa».
Questo meccanismo è alla base del funzionamento della tecnologia CRISPR/Cas . Ma tutto cio’ cosa c’entra col gene editing e quindi con la correzione del genoma per guarire patologie ereditarie?

«Quello che hanno fatto i ricercatori -ha evidenziato il dr. Lombardo- è stato di adattare questo sistema al gene editing. I ricercatori hanno, infatti, usato la proteina Cas9 in cellule eucariotiche (es. umane o di topo) e hanno contemporaneamente espresso dei piccoli RNA che erano complementari a una sequenza di interesse nel genoma eucariotico umano o di topo. Questi piccoli RNA guidano il Cas9 sul DNA umano o di topo e qui l’enzima rompe la doppia elica del DNA. Questo processo che è alla base del gene editing si fonda sulla rottura della doppia elica del DNA che in questo caso viene fatta con le CRISPR/Cas».

Ci sono anche altri enzimi  che possono rompere la doppia elica del DNA e inserire nuovi frammenti come la tecnologia del  Zinc Finger Nucleasi o delle TALE Nucleasi.

«Queste tecnologie -ha precisato il dr. Lombardo- stimolano i processi di riparazione del DNA tra cui la ricombinazione omologa che è un processo che le cellule eucariotiche sfruttano per riparare le rotture della doppia elica del DNA. Si tratta di un processo molto fedele che ripara questa sequenza rotta come era prima; il ricercatore a questo punto può veicolare nella cellula una sequenza di DNA di interesse (un gene di interesse, una resistenza  a un particolare antibiotico o a una droga) e questa sequenza esogena viene fiancheggiate da braccia di omologia, cioè sequenze identiche a  quelle presenti sul genoma dove è avvenuto il taglio della doppia elica di DNA. Queste sequenze esogene, quindi , vengono inserite esattamente dove è avvenuto il taglio grazie al processo di ricombinazione omologa.

Il gene editing funziona indipendentemente dalla nucleasi usata (CRISPR/Cas o altre).
Per quanto riguarda le applicazioni si possono distinguere in due tipi: correzione di una singola mutazione puntiforme del genoma oppure “inattivazione” di un gene. In questo ultimo caso, la sequenza che questo gene codifica viene distrutta e riparata e durante la riparazione vengono inserite delle mutazioni (persi o acquisiti nuovi nucleotidi).

Il gruppo in cui lavora il dr. Lombardo al San Raffaele è molto attivo nella ricerca sul gene editing come strumento terapeutico per patologie quali le immunodeficienze ereditarie.

«Nel laboratorio in cui lavoro ci occupiamo principalmente di gene editing per correzione genica. In particolare, il nostro obbiettivo è di correggere le mutazioni geniche nelle cellule staminali ematopoietiche del paziente che, una volta corrette, sono reinfuse nel malato. ».

Ci sono alcuni casi in cui invece di correggere un gene è meglio disattivarlo, in quanto potrebbe trattarsi di un gene mutato la cui espressione porta a una malattia (mutazioni dominanti negative).

“Rieducazione dei linfociti killer”
«Esistono altre applicazioni -ha sottolineato il dr. Lombardo- come nel caso dei tumori in cui si possono modificare i linfociti del paziente. I linfociti sono cellule che hanno un’attività di killing di cellule infettate o tumorali. Attraverso il gene editing  si puo’ cambiarne la specificità del singolo linfocita in modo che riconosca solo (o quasi) la cellula tumorale e la uccide.  E’ un approccio molto potente.

Il gene editing per la distruzione dei geni è una tecnologia già utilizzata in clinica ma non la correzione genica ,è uno degli obiettivi del laboratorio Tiget in cui lavoro.

Per quanto riguarda la correzione genica ad oggi siamo interessati alle immunodeficienze ereditarie, malattie in cui non si sviluppa il sistema immunitario e quindi i bambini affetti non riescono a rispondere ad alcun patogeno.  Quella che stiamo maggiormente studiando si chiama X-linked Severe Combined Immunodeeficiency (immunodeficienza severa combinata legata al cromosoma X). Proprio lo scorso anno abbiamo pubblicato sulla rivista Nature la prima prova di principio che il gene editing può essere utilizzato per correggere malattie ereditarie in cellule staminali ematopoietiche.

Ricercatori di fama mondiale sostengono che il metodo permetterà di curare malattie che attualmente sono incurabili. Tra queste malattie rientrano anche l'anemia falciforme, causata da modifiche a singole coppie di basi della sequenza genetica del DNA che potrebbero essere corrette dalla tecnologia precisa del CRISPR /Cas.

Quali sono i partner con cui lavorerà Astra Zeneca?

Il primo è la Wellcome Trust Sanger Institute di Cambridge. Secondo i termini della collaborazione con questo istituto la ricerca si concentrerà sulla cancellazione di geni specifici relativi al cancro ma anche  cardiovascolari, per malattie metaboliche, respiratorie, autoimmuni e malattie infiammatorie e la medicina rigenerativa per comprendere il loro ruolo preciso in queste condizioni. AstraZeneca fornirà linee cellulari che possono essere modificate col la tecnologia CRISPR per generare popolazioni di cellule nelle quali definiti geni sono spenti. I geni saranno successivamente identificati mediante sequenziamento e verranno testate popolazioni cellulari di nuova generazione per convalidare gli effetti di un dato gene su una vasta gamma di caratteristiche fisiche e biologiche.

Il dr Kosuke Yusa, dell'Istituto Sanger ha dichiarato: "La libreria di RNA guida del nostro istituto permette ai ricercatori di targhettare geni con incredibile specificità. La tecnologia CRISPR ha trasformato il modo in cui si studia il comportamento delle cellule e ora l'applicazione di questa potente tecnologia per la ricerca di farmaci efficaci."

Innovative Genomics Initiative, California
Innovative Genomics Initiative (IGI) è una joint venture tra l'Università della California a Berkeley e l'Università della California a San Francisco. La collaborazione di ricerca si concentrerà  sia sull’inibizione (CRISPRi) che sull'attivazione (CRISPRa) di geni per capire il loro ruolo nella patologia della malattia. L'IGI e AstraZeneca lavoreranno a stretto contatto per identificare e validare bersagli genici in relazione al cancro, cardiovascolari, metaboliche, respiratorie, malattie autoimmuni e infiammatorie e la medicina rigenerativa per comprendere il loro ruolo preciso in queste condizioni.

Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts
Anche in questo caso AstraZeneca riceverà librerie di RNA-guida che hanno come target i singoli geni noti umani e famiglie di geni. AstraZeneca utilizzerà queste guide contro linee cellulari per identificare nuovi target di malattia.

Broad Institute / Whitehead Institute, Cambridge, Massachusetts
La collaborazione con il Broad Institute e Whitehead Institute è improntata alla valutazione di una libreria CRISPR  dell’intero genoma contro un pannello di linee cellulari di cancro al fine di identificare nuovi obiettivi per la scoperta di farmaci contro il cancro.

Oltre alle nuove collaborazioni, il programma di AstraZeneca in-house sta attualmente adattando la tecnologia CRISPR per semplificare e accelerare la produzione di linee cellulari e modelli traslazionale che imitano complessi scenari genomici e malattie rilevanti.

In conclusione, CRISPR/cas  è una tecnologia potente che permette di manipolare geni di potenziale importanza nei percorsi di malattia e di esaminare l'impatto di queste modifiche con alta precisione. Laboratori di tutto il mondo stanno studiando come migliorare e applicare questa tecnologia e l’Italia col San Raffaele ma anche altri istituti di ricerca è all’avanguardia in queste ricerche.


Emilia Vaccaro