Le molecole dirette contro l’NS5A, proteina non strutturale del virus dell’epatite C, sono considerate i più potenti composti anti-Hcv mai scoperti. Il loro tallone di Achille sta nella capacità di selezionare velocemente virus resistenti ai farmaci e, per essere efficaci, devono essere utilizzati con altri potenti agenti antivirali diretti (DAA), per prevenire la resistenza clinica. Un revisione sistematica della letteratura recentemente pubblicata su Infection and Drug Resistance ha fatto il punto della situazione sui complessi meccanismi finora conosciuti alla base dell’azione di queste molecole.

L’infezione da virus dell’Hcv è un problema di salute mondiale considerando che le persone infette in tutto il globo sono intorno alle 170 milioni, di cui il 70%-85% evolve verso epatite cronica, steatosi, cirrosi e carcinoma epatocellulare. Negli Stati Uniti l’Hcv ha superato l’immunodeficienza acquisita ed è la prima causa di morte dovuta ad agenti infettivi.

Tale virus appartiene alla famiglia delle Flaviviridae ed ha un ciclo di replicazione coinvolgente il citoplasma. Il suo genoma è composto da un singolo filamento di RNA che codifica per tre proteine strutturali (core, E1 e E2), per la proteina canale p7 e per 6 proteine non strutturali (NS2, NS3, Ns4A, NS4B, NS5A e NS5B). Ognuna di queste proteine ha un ruolo nell’ingresso dell’Hcv nell’organismo, nell’infezione, nella replicazione e nella maturazione e quindi ognuna può essere target potenziale dell’azione di farmaci.

Ma l’Hcv è fortemente eterogeneo e ciò limita lo sviluppo di una terapia universale; esistono infatti 6 genotipi principali dell’Hcv e diversi altri sottotipi identificati nel mondo. I sottotipi 1a/b generano la maggior parte delle infezioni (70%) negli Stati Uniti, Europa, Cina e Giappone, la restante percentuale è coperta dai genotipi 2, 3 e 4. Il genotipo condiziona la risposta alla terapia. La risposta virologica sostenuta, infatti, viene raggiunta solo dal 40%-50% dei pazienti con genotipo 1 trattati con la terapia standard di interferone e ribavirina e dal 75%-85% degli individui con genotipo 2 e 3.

I primi agenti antivirali diretti approvati sono stati telaprevir e boceprevir nel 2011. Queste due molecole agiscono sull’NS3/4A  ed attualmente sono utilizzati in diversi paesi in abbinamento a interferone e ribavirina; purtroppo molti soggetti non sopportano tale terapia e quindi hanno bisogno di nuovi trattamenti.

A tal proposito in sviluppo clinico ci sono molti agenti diretti da utilizzare da soli per il trattamento dell’Hcv; molti di questi sono diretti verso la proteina NS5A che risulta formata da 447 amminoacidi ancorata al reticolo endoplasmatico attraverso l’alfa-elica terminale. La struttura di tale proteina è stata determinata attraverso studi di spettroscopia di risonanza e di cristallizzazione e confermata successivamente attraverso test in vitro. In sintesi, sono stati identificati tre domini: D-I coinvolto nella dimerizzazione, DII nel legame alla ciclofillina A e con il potenziale di antagonizzare la risposta innata all’Hcv e DIII importante nell’assemblaggio delle particelle virali infettive.

I ricercatori hanno trovato che l’Hcv è capace di formare un complesso di replicazione associato alla membrana formato da proteine virali, l’RNA in replicazione e le membrane cellulari alternate. Tutte le proteine NS dell’Hcv, inclusa la NS5A, interagiscono con le membrane cellulari dell’ospite direttamente come proteine leganti le membrane oppure attraverso la proteina di ancoraggio alle membrane NS4A. Si creano delle forti interazioni, fondamentali per la replicazione virale per cui modifiche di residui impattano fortemente sulla localizzazione nel reticolo endoplasmatico e sulla replicazione dell’RNA. La proteina NS5A riesce a legarsi con molti fattori cellulari e virali e con l’RNA facilitando la produzione di particelle virali. Interagisce anche con molte proteine dell’ospite e riesce a modulare la risposta alla terapia con interferone alfa. La sua interazione con l’ospite fa in modo che si producano radicali liberi e stress ossidativo. Inoltre, interagisce con una chinasi dell’ospite, la fosfatifdilinositolo-4-chinasi alfa (PI4KIIIalfa) stimolando la sua azione e quindi anche la replicazione dell’Hcv; tra l’altro tale chinasi, a seguito dell’infezione, trasloca andandosi a co-localizzare con l’NS5A.  Anche altre proteine sembrano avere lo stesso comportamento quindi appare chiaro il coinvolgimento dell’NS5A come modulatore del processo di replicazione dell’Hcv.

Gli autori di questo lavoro di revisione della letteratura hanno quindi analizzato le fasi della diminuzione dell’RNA per l’Hcv nel siero dopo trattamento con un inibitore dell’NS5A.

Tale decremento  è multifasico; inizialmente c’è un rapido calo nelle prime 6 ore con effetto sull’assemblaggio e secrezione del virus, seguito da un declino più lento con tempo di dimezzamento di 6-9 ore con effetto sulla sintesi dell’RNA. In entrambe le fasi l’inibitore dell’NS5A interagisce con le molecole sopra nominate dell’ospite e la sua azione, esplicandosi sia sui nuovi complessi di replicazione che sulla maturazione delle particelle virali, è realmente efficace nel raggiungimento della SVR12. Sono a tal fine importanti anche le dosi di trattamento per mantenere lo steady state. Le formulazione once-daily sono molto più semplici e sono valide quelle con un t1/2 lungo come nel caso del  ledipasvir (49.7 ore), ABT-267 (28.1 ore) e daclatasvir (12.8 ore) mentre i farmaci con un t ½ più breve sono comunque efficaci ma soprattutto nel mantenimento dello steady state.

Il daclatasvir è stato scoperto attraverso l’high throughput screening identificando mutazioni selezionate nella regione codificante dell’NS5A. Similmente sono stati identificate altre molecole strutturalmente simili raggruppate in due classi; nella classe I sono presenti composti dimerici come il daclatasvir (BMS-790052), GSK-2336805 e ledipasvir (65-5885); nella classe II sono inclusi monomeri meno attivi della classe I, con potenza dell’ordine delle nanomoli e non picomoli, il più potente dei quali risulta il “Composto 4” della Merck and Co, Inc; ci sono anche la 4-anilino chinazolina (AL-9) della Arrow Therapeutics Limited che inibisce anche la PI4KIIIalfa e riduce i livelli di PI4P nelle membrane plasmatiche, che regolano la propagazione virale.

Le sostituzioni di alcuni gruppi chimici in tali molecole cambiano la loro potenza, come nel caso della sostituzione del fenile con strutture di collegamento non aromatiche che diminuisce di 1000 volte la potenza. L’aggiunta di sostituzioni alogene all’anello B riesce a recuperare la potenza nel composto parentale inattivo suggerendo un ruolo fondamentale della conformazione nella potenza. Sono state esplorate diverse sostituzioni per aumentare la potenza e l’attività di tali composti.

I ricercatori della Gilead Sciences hanno usato modelli computerizzati per analizzare il farmacoforo chiave responsabile dell’alta attività dei dimeri di classe 1 ed hanno teorizzato l’importanza di un idrogeno intramolecolare legato tra le regioni B e C per stabilizzare una conformazione simile ad un peptide “gamma-turn”. Hanno così sviluppato dei composti attivi a concentrazioni picomolari suggerendo una nuova generazione di composti in cui la simmetria e l’alto peso molecolare dei dimeri non sono critici per l’interazione con l’NS5A.

Modelli di struttura hanno dimostrato il potenziale per identificare i domini target e le interazioni spaziali che razionalizzano la selezione di mutazioni resistenti in specifiche posizioni all’interno dell’N5SA e potenziali partners di legame; questa tipologia di studi migliorerà la conoscenza di queste molecole e consentirà la scoperta di altre con una più alta barriera alla resistenza.

La terapia a base di molecole target per l’NS5A ha dimostrato una grande capacità di inibizione della replicazione dell’RNA dell’Hcv, con minima tossicità in vivo.

In conclusione, al momento ci sono 3 classi principali di agenti antivirali diretti (DAA) in sviluppo clinico: inibitori delle proteasi NS3/4A, inibitori della polimerasi NS5B e inibitori diretti della NS5A. Le molecole, appartenenti alla classe degli inbitori dell’NS5A e che sono attualmente più avanti in sviluppo clinico (fase III), sono il daclatasvir,  il ledipasvir e l’ABT-267. Tali composti agiscono a concentrazioni bassissime dell’ordine delle picomoli per cui è abbastanza difficile individuare l’esatto meccanismo d’azione. In generale, gli inibitori dell’NS5A dell’Hcv possono agire: inibendo la replicazione virale, facendo sinergismo con altri DAA, forse modulando altre proteine virali edaiutando nella soppressione della resistenza ai virus. La combinazione di più DAA  potranno curare milioni di individui affetti da Hcv fino all’eradicazione globale di tale virus.

Emilia Vaccaro
Kohler J et al. Approaches to hepatitis C treatment and cure using NS5A inhibitors. Infect and Drug Resist. Mar 5;7:41-56
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